Цветы против гнили

Текст: Сулинг Ян, Мейфанг Сонг, Гуйцзюнь Лю, Сицзин Чжоу, Ючен Цяо, Пин Ван, Хайкэ Гу, Лицинь Ву, Институт радиационных технологий Пекинской академии науки и техники; Лимэй Ци, факультет электронной техники Пекинского университета почты и телекоммуникаций [1].

Послеуборочные болезни, вызываемые различными патогенами, оказывают пагубное влияние на сохранность плодов и приводят к значительным экономическим потерям. Помочь в решении проблемы могут агенты биологического контроля.

Кольцевая гниль груши, вызываемая грибом Botryosphaeria dothidea, сильно ухудшает качество и срок хранения плодов. В свою очередь, эндофиты растений являются потенциально перспективными источниками агентов биоконтроля благодаря их способности продуцировать новые биологически активные продукты. В данной работе ученые рассмотрели эндофитный штамм B1, выделенный из корней орхидеи Dendrobium huoshanense.

ОПАСНЫЙ ПАТОГЕН

Груша является одним из широко культивируемых фруктов в мире. В процессе выращивания она подвержена воздействию различных вредителей и болезней, среди которых одним из наиболее опасных является гриб Botryosphaeria dothidea. Он может поражать не только плоды, но и листья, а также стволы деревьев, вызывая кольцевую гниль плодов, а также раковые и диверсионные заболевания. Примечательно, что патоген не имеет предпочтений в отношении хозяев и, по имеющимся данным, может развиваться на широком спектре растений, важных для сельского хозяйства, что делает его проблемой глобального масштаба. Кроме того, он иногда инфицирует людей, становясь причиной хронического грибкового заболевания — феогифомикоза. В недавних исследованиях также было показано, что данный патоген имеет тенденцию к накоплению соединений, токсичных для клеток млекопитающих.

Сейчас для борьбы с B. dothidea широко используются химические фунгициды, что создает проблемы для окружающей среды и здоровья населения. По этой причине остро встает необходимость поиска альтернативы пестицидам, которая была бы безопасна для производства продуктов питания и не наносила бы вред природе. Использование микробных агентов для биологической борьбы с патогенами представляет собой перспективную стратегию.

АГЕНТЫ БИОКОНТРОЛЯ

В последние годы появились сообщения о том, что микроорганизмы продуцируют биологически активные соединения, обладающие биоконтрольными свойствами. Многие исследования посвящены бактериям и грибам из ризосферы растений, однако эндофиты постепенно привлекают все большее внимание ученых во всем мире благодаря способности продуцировать новые биологически активные соединения. Эндофиты — разнообразные микроорганизмы, живущие внутри растений и не вызывающие никаких признаков инфекции. Они занимают сходную с фитопатогенами экологическую нишу, что делает их перспективными кандидатами в агенты биоконтроля. Эндофиты были обнаружены в каждом растительном организме. Хотя на Земле существует около 300 тыс. видов растений, лишь часть из них была тщательно изучена на предмет наличия эндофитов. По этой причине большие усилия по их изучению в различных экосистемах могут дать возможность получить новые и ценные вещества, которые могут найти применение в сельском хозяйстве.

Орихидея Dendrobium huoshanense является уникальным лекарственным растением, обладающим полезными свойствами, и ее эндофитные бактерии и грибы отличаются богатством и разнообразием. В связи с этим ученые из Китая поставили перед собой цель выделить из данного вида эндофитные бактерии с антагонистической активностью и оценить их защитный эффект против B. dothidea на грушах после уборки.

ЗАРАЖЕНИЕ И АНАЛИЗ

Для выделения эндофитных бактерий из образцов орхидеи, отобранных в китайской провинции Аньхой, корни тщательно промывали водопроводной водой, поверхностно стерилизовали в 75%-ном этаноле в течение 30 с и в 3%-ном растворе NaClO в течение трех минут, затем пять раз ополаскивали в стерильной воде. Обеззараженные корни разрезали на кусочки размером один сантиметр, помещали в чашки Петри с пептонной средой и говяжьим экстрактом (среда BPN) и инкубировали при 28°C. В этом случае из корней выходили как эндофитные бактерии, так и грибы. Первые отличались явной антагонистической активностью по отношению к вторым, поэтому они были выделены и очищены, после чего хранились при –80°C в 20%-ном глицерине.

Возбудитель кольцевой гнили Botryosphaeria dothidea был выделен из пораженных плодов груши и законсервирован в лаборатории. Для оценки антагонистических способностей полученных эндофитов против B. dothidea использовали метод двойной культуры. Из девяти штаммов только вариант B1 проявил наиболее сильную антагонистическую активность и был выбран для дальнейшей характеристики. Для этого плоды груши, однородные по размеру, не имеющие механических повреждений и инфекций, отбирали, стерилизовали 75%-ным спиртом в течение минуты и высушивали на воздухе. Для оценки биоконтрольной эффективности каждую ранку плода инокулировали 30 мкл штамма В1 в объеме 5×107 КОЕ/мл. В качестве контроля использовали стерилизованную дистиллированную воду. Через 12 ч на повреждения также наносили частицы мицелия B. dothidea, взятого с краев семидневной колонии. Обработанные груши инкубировали в климатических камерах при температуре 25°C и относительной влажности 85% в течение семи дней в трех повторностях по восемь экземпляров в каждой. Определяли пораженность плодов болезнью и диаметр распространения, а также рассчитывали коэффициент ингибирования (%) по формуле: (dконт. – dобр.)/dконт. × 100%, где d — диаметр гнили. Для получения дальнейших точных данных ученые использовали разные методы, в частности секвенирование генома, филогенетический анализ, геномный майнинг кластеров генов биосинтеза вторичных метаболитов, статистический и масс-спектрометрический анализ вторичных метаболитов, продуцируемых штаммом В1.

ЭФФЕКТ ПОДАВЛЕНИЯ

В ходе исследования рост B. dothidea заметно подавлялся штаммом B1, причем через одну неделю инкубации уровень ингибирования составил 73,2% по сравнению с контролем. Световые микроскопические наблюдения показали, что морфология мицелия гриба была сильно искажена эндофитом. Структура гиф имела неравномерную толщину, а некоторые из них образовывали набухшие пузырьки, которые в конечном итоге лопались, что приводило к вытеканию внутриклеточного материала. Контрольный мицелий, напротив, имел равномерную толщину и гладкую поверхность, характеризовался энергичным ростом.

Полученный эндофит также был изучен на предмет выработки антимикробных соединений против гриба в жидкой культуре, а для сравнения противогрибковых свойств клеточных суспензий (CS) и бесклеточных супернатантов (CFS) использовался метод коллекторной диффузии. Через одну неделю инкубации на среде PDA гифальное разрастание B. dothidea значительно подавлялось. Примечательно, что суспензии оказались более эффективными по сравнению с супернатантами, создавая более широкую зону ингибирования. В этом случае высокий уровень антагонистической активности CS может быть связан с дополнительным биосинтезом противогрибковых метаболитов активно растущими клетками штамма B1 на среде PDA по сравнению с CFS.

Заболеваемость плодов кольцевой гнилью, вызванной B. dothidea, была значительно снижена в группе, обработанной эндофитом. На контроле заболевание стало проявляться через три дня после инокуляции, тогда как обработка B1 полностью подавляла инфицированность груши до пятого дня после проведения операции. Затем симптомы кольцевой гнили начали фиксироваться на опытных плодах. Через семь дней после инокуляции в контрольной группе болезнью было заражено более 50% экземпляров, а средний диаметр поражения составил 4,31 см. В то же время данный параметр у опытных образцов равнялся в среднем 1,3 см, что оказалось на 73,4% меньше, чем на контроле. Штамм В1 действенно замедлял возникновение и развитие кольцевой гнили плодов груши, достигая хорошего контрольного эффекта.

КЛАСТЕРЫ ГЕНОВ

Использование агентов биоконтроля является экологически чистой альтернативой химическим соединениям для борьбы с болезнями плодовых. Эндофиты растений привлекают большое внимание благодаря их способности продуцировать биологически активные вещества, отличающиеся структурным разнообразием, что делает их потенциальными антагонистами. Например, было обнаружено, что особые микроорганизмы лекарственного тонкосемянника метловидного могут быть искусственно инокулированы в киви и контролировать заболевание раком, вызванное Pseudomonas syringae pv. actinidiae, что указывает на возможность переноса эндофитов в растения, не являющиеся хозяевами, с сохранением их биоконтрольных свойств. Аналогичным образом штамм B. subtilis R31, выделенный из листьев орхидеи Dendrobium, оказывал значительное действие на фузариозное увядание восприимчивых сортов банана, что является еще одним характерным примером проявления обозначенных особенностей. Таким образом, эндофиты растений могут быть использованы в качестве перспективных биоконтрольных агентов.

В проведенном китайскими учеными исследовании эндофитная бактерия штамма B1 проявила значительную антагонистическую активность против Botryosphaeria dothidea и эффективно боролась с послеуборочной кольцевой гнилью груши. На основании филогенетического анализа основных генов он был идентифицирован как Bacillus velezensis. Данный штамм содержит кластеры генов, отвечающих за синтез липопептидов — итурина, фенгицина, сурфактина и бациллибактина, поликетидов — макролактина, бациллена и дифицидина, а также бацилизина.

НЕ ТОЛЬКО ГРУШИ

Помимо этого проведенные исследования показали, что штаммы B. velezensis способны продуцировать ряд активных метаболитов, обладающих более сильными и широкими спектрами антимикробных свойств по сравнению со штаммами B. amyloliquefaciens и B. siamensis. В связи с этим они привлекают внимание как потенциальные агенты биологического контроля. В соответствии с полученными результатами недавние исследования подтвердили, что эндофитный штамм B. velezensis является важным источником антагонистов. Кроме того, вариант B. velezensis P2-1, выделенный из ветвей яблони, значительно подавлял рост B. dothidea и снижал заболеваемость яблони кольцевой гнилью, вызванной B. dothidea. В то же время штамм B. velezensis OEE1, полученный из корней оливковых деревьев, показал выраженное ингибирование роста мицелия Verticillium dahliae и эффективно контролировал фузариозное увядание растений в тепличных и полевых условиях. Вариант B. velezensis BLE7, выделенный из сизаля, проявил сильный биоконтрольный эффект в отношении антракноза, вызванного Colletotrichum musae на бананах, снизив развитие болезни до 97% по сравнению с положительным контролем.

Таким образом, было показано, что эндофитный изолят Bacillus velezensis B1 проявляет сильное ингибирующее действие против возбудителя кольцевой гнили груши Botryosphaeria dothidea in vitro и in vivo. Штамм B1 содержит кластеры генов, отвечающих за выработку итурина, фенгицина и сурфактина, являющихся мощными биоконтрольными агентами против B. dothidea. Примечательно, что выработка и распространение этих липопептидов в зоне ингибирования значительно усиливались в присутствии B. dothidea. Данная работа может обеспечить безопасный биологический подход к борьбе с кольцевой гнилью груши.

[1] Источник: Журнал Horticulturae 2023, 9 (9). Текст печатается с сокращениями по лицензии Creative Commons.