Дождевые черви на службе садов
Текст: Вэйтао Цзян, Ран Чен, Лефен Сон, Лэй Цинь, Синь Сюй, Цзыхуэй Сюй, Ли Сян, Сюэсэнь Чэнь, Чэнмяо Инь, Янфань Ван, Чжицюань Мао, Шаньдунский сельскохозяйственный университет (SDAU); Фэнбин Пань, Шаньдунский сельскохозяйственный и инженерный университет (SDAEU) [1]
Выращивание яблок в заново высаженных садах является необходимым в условиях стареющих насаждений и ограниченности земельных ресурсов. Однако присутствие грибов рода Fusarium и фенольных кислот в почве на таких территориях препятствует устойчивому развитию отрасли.
Яблони являются одними из наиболее широко культивируемых фруктовых деревьев в мире. При этом их непрерывная посадка может привести к появлению чахлых саженцев, ослаблению растений, обострению болезней и распространению вредителей. В целом совокупность данных явлений получила за рубежом название болезни пересадки яблонь (apple replant disease, ARD).
НЕГАТИВНАЯ СОВОКУПНОСТЬ
Заболевание было обнаружено в различных странах, в том числе в США, ЮАР и ЕС, и стало одним из основных факторов, влияющих на возвращение в эксплуатацию старых яблоневых садов. ARD приводит к крупным экономическим потерям, угрожает развитию мировой яблочной промышленности и вызывается как биотическими, так и абиотическими факторами. Первые включают воздействие грибов — Fusarium, Rhizoctonia, оомицетов — Phytophthora, Pythium, нематод — Pratylenchus, вторые — накопление токсичных элементов в почве, ухудшение ее физико-химических свойств и дисбаланс питательных веществ в ней. Ранее учеными было обнаружено, что содержание флоризина в грунте под старыми фруктовыми садами положительно коррелирует со степенью распространенности ARD. Кроме того, большое количество этого глюкозида, выделяемого остатками корней, может нанести серьезный ущерб пересаженным растениям. Фталевая кислота также значительно угнетает рост саженцев яблони. В то же время некоторые исследования показали, что помимо прямого подавления развития культур фенольные кислоты могут косвенно способствовать увеличению патогенных грибов Fusarium. Это изменяет структуру почвенного микробного сообщества и провоцирует возникновение заболевания.
Одним из наиболее действенных способов борьбы с упомянутой болезнью является фумигация почвы перед посадкой молодых яблонь. Однако бромистый метил, обладающий хорошим эффектом, ограничен или запрещен к применению во многих странах из-за наносимого им вреда окружающей среде. Другие химические фумиганты также широко используются для уничтожения патогенов в почве, но они часто убивают или подавляют рост полезных микроорганизмов. Более того, для экологичных и органических многолетних насаждений подобные вещества не подходят.
ЛЕКАРСТВО ИЗ ЧЕРВЕЙ
Высокоэффективные бактерицидные свойства широкого спектра действия демонстрируют антимикробные пептиды. Они могут вырабатываться беспозвоночными, в частности дождевыми червями, являющимися первой линией обороны против патогенных микроорганизмов. В последние годы антимикробные пептиды последовательно применяются в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Ранее учеными было обнаружено, что экстракты из жидкости тела дождевых червей оказывают подавляющее действие на рост грибов Fusarium oxysporum, существенно влияющих на сельхозпроизводство. Малые молекулярные пептиды, содержащиеся в этих веществах, также обладают антимикробной активностью. Очищенные продукты из кишечной жидкости этих беспозвоночных, выделенные методом колоночной хроматографии, отличаются высокой антибактериальной активностью широкого спектра действия. Численность Fusarium может быть значительно снижена при мульчировании почвы дождевыми червями для обработки соломенных остатков. Компостируемая ими вода также может подавлять рост грибковых мицелиев. Важно отметить, что ранее не сообщалось о применении антимикробных пептидов для профилактики и борьбы с болезнью пересадки яблонь, а их содержание в биологических жидкостях дождевых червей было слишком малым для удовлетворения потребностей производства. Получение таких веществ путем протеолиза, или микробной ферментации, — распространенная стратегия, используемая в исследованиях. При этом наиболее безопасными штаммами, которые используются в промышленной ферментации, считаются B. subtilis и A. niger.
В связи с этим специалисты двух китайских университетов провели научные исследования. В ходе работы изучались два вопроса: может ли ферментация дождевых червей B. subtilis и A. niger производить антимикробные пептиды, а также способны ли получаемые при этом продукты облегчить ARD и стать реальной заменой бромистого метила. Исследователи выполнили лабораторные эксперименты по оптимизации условий изготовления антимикробных пептидов путем ферментации дождевых червей. Также были осуществлены полевые эксперименты с целью проверки потенциала производных продуктов для восстановления почвенной среды при пересадке и стимулирования роста молодых яблонь. Результаты исследования дают новые знания, которые помогут в разработке методов профилактики и борьбы с ARD.
УСЛОВИЯ ФЕРМЕНТАЦИИ
В экспериментах был использован компостный червь Eisenia foetida. Ферментационные штаммы B. subtilis и A. niger приобретались в Китайском общем центре сохранения и управления микроорганизмами. В качестве тестируемых грибов применяли Fusarium oxysporum, F. proliferatum, F. solani и F. moniliforme, которые ранее были подтверждены лабораторией университета как возбудители болезни пересадки яблонь.
Гомогенат тканей готовили путем добавления дождевых червей и воды в массовом соотношении 4:1 в специальное оборудование. После пастеризации полученную взвесь добавляли к ферментационным штаммам до достижения объемной пропорции 1000:1 между первым и вторым компонентами. Эффективное количество жизнеспособных бактерий B. subtilis составляло 1×109 КОЕ/мл, концентрация спор A. niger — 1,2×109 КОЕ/мл, и они использовались для аэробной ферментации при 28, 31, 34 и 37°C. Производные продукты были получены в течение 10 дней. После этого четыре вида грибов Fusarium были инокулированы в различные пластины с картофельно-декстрозным агаром, смешанным с миллилитром продуктов ферментации дождевого червя. Плитки запечатывали герметичной пленкой и размещали в течение семи дней в инкубаторе при температуре 28°C. Для измерения диаметра колоний каждого вида использовали метод крест-накрест. Скорость ингибирования роста против четырех видов Fusarium рассчитывали по формуле: интенсивность ингибирования (%) = [(диаметр колонии контроля – диаметр колонии лечения)/диаметр колонии контроля] × 100.
ПОЛЕВЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ
Спустя время проводились практические исследования в трех деревнях у города Лайчжоу в китайской провинции Шаньдун. На каждом участке выполнялось пять одинаковых экспериментальных обработок, которые включали контроль (CK), фумигацию бромистым метилом (SS), применение продуктов ферментации дождевого червя (EF) и их стерилизованные варианты (SE), а также неферментированный гомогенат ткани беспозвоночных (NE). На вариантах с EF, SE и NE по 300 мл опытного раствора были смешаны с 25 кг воды и вылиты в различные посадочные ямы. На контрольной делянке для приготовления смеси использовалось 300 мл стерильной воды. Саженцы яблони M9T337 с привоем Yanfu 3 были высажены через пять дней. Ствол обрезался до 1,4 м, плотность посадки составляла 4×1,5 м, и в каждом варианте было посажено 20 деревьев.
В течение двух лет собирались образцы почвы посредством пятиточечного метода. В рамках него использовалась стерилизованная маленькая лопата для удаления поверхностного слоя и выкапывания корней яблони. Почва, плотно прикрепленная к ним, отряхивалась стерильной щеткой, при этом применялось двухмиллиметровое сито для отсеивания примесей. Образцы помещали в ящик со льдом и сразу же перевозили в лабораторию. После этого грунт разделялся на три герметичных пакета. Один из них поместили в холодильник при температуре 4°C для последующего определения культивируемых в почве микроорганизмов. Вторая проба размещалась при температуре –80°C для количественного флуоресцентного анализа в реальном времени (qRT-PCR) и высокопроизводительного секвенирования. Последний пакет высушили на воздухе для последующего определения содержания фенольных кислот и активности почвенных ферментов. Помимо этого в течение двух лет специалисты измеряли высоту саженцев, диаметр основания и длину ветвей яблони, а на третий год — урожайность плодов, содержание растворимого сахара, титруемой кислоты, антоцианов и компонентов аромата.
ПАРАМЕТРЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ
Продукты для обработки подавляли рост грибов Fusarium при различных температурах ферментации, причем ингибирующее действие напрямую зависело от данного показателя. Так, при 37°C отмечалось наиболее сильное влияние на F. proliferatum, F. solani и F. moniliforme, поэтому данный уровень был определен как оптимальная температура ферментации.
Степень ингибирования производных продуктов против четырех видов Fusarium была выше 76% при различных начальных значениях pH. Когда этот параметр оказывался ниже семи единиц, уровень подавления грибов увеличивался по мере его возрастания. При значении водородного показателя выше семи единиц скорость ингибирования Fusarium снижалась по мере его роста. Наивысший эффект фиксировался при исходном pH в семь единиц.
Скорость подавления патогенных грибов продуктами ферментации дождевого червя быстро увеличивалась по мере возрастания времени воздействия. Так, данный параметр достигал максимума, когда количество дней влияния составляло 10. При этом скорость ингибирования F. oxysporum, F. solani, F. proliferatum и F. moniliforme составляла 79,8, 75,1, 78,7 и 79,2% соответственно. Через 10 суток уровень подавления не возрастал. Более того, в отношении некоторых видов Fusarium показатель немного снизился. Таким образом, оптимальное время воздействия продуктами ферментации дождевого червя составляло 10 дней.
ВЛИЯНИЕ НА СПОРЫ
Три разновидности обработки подавляли рост четырех видов Fusarium, причем наиболее сильное действие отмечалось на варианте EF, после чего следовали операции с применением стерилизованных продуктов (SE) и гомогената ткани червя (NE). Для изучения морфологии мицелия F. solani, обработанного стерильной водой и EF, была использована сканирующая электронная микроскопия. При использовании воды мицелий рос нормально, его морфология была обычной, поверхность гладкой, точка роста — круглой и полной, изломы наблюдались редко. Однако целостность была утрачена, большая часть мицелия была сломана и повреждена, точки роста деформированы, а внутреннее содержимое можно было увидеть за пределами органа. Обработка EF также подавляла прорастание спор Fusarium. Уровень ингибирования грибов F. oxysporum, F. solani, F. proliferatum и F. moniliforme составил 83,8, 87,3, 83,2 и 84,8% соответственно. Пептиды с молекулярной массой менее 1,5 кДа были выделены из продуктов ферментации дождевого червя (EF) для бактериостатических тестов. Степень ингибирования F. oxysporum, F. solani, F. proliferatum и F. moniliforme с помощью полученных фрагментов составила 76, 65,5, 72,3 и 70% соответственно, что свидетельствовало об антибактериальной активности данных веществ.
Следует отметить, что все обработки в разной степени снижали содержание фенольных кислот в садах на трех участках. Самым низким данный параметр оказался на варианте EF, после чего следовали операции с SE, NE, SS и CK. Существенная разница в концентрации фенольных кислот между обработками EF и SE отсутствовала. Помимо этого все процедуры в разной степени повышали активность почвенных ферментов в пересаженных садах на трех участках в схожих закономерностях. Также отмечалось снижение численности четырех видов Fusarium. Степень их сокращения была самой высокой при обработке SS, затем следовали варианты EF, SE, NE и CK.
УЛУЧШЕНИЕ СРЕДЫ
Таким образом, типичными проявлениями болезни пересадки яблонь являются низкорослость саженцев, обострение различных заболеваний и поражение растений вредителями, снижение урожайности и качества плодов. В эксперименте китайских ученых добавление продуктов ферментации дождевых червей значительно усилило развитие новых деревьев. Исследования показали, что интенсивный рост способствовал повышению их устойчивости к болезням и снижению вероятности возникновения ARD. Это указывало на то, что использование тестируемых веществ уменьшило ущерб, нанесенный пересаженным фруктовым деревьям.
В проведенном эксперименте применение продуктов ферментации дождевого червя улучшило микроэкологическую среду почвы, значительно увеличило численность культивируемых бактерий и актиномицетов в ней, уменьшило количество грибов и повысило соотношение первых и вторых. Благодаря этому почва пересадки превратилась в грунт с высоким содержанием удобрений «бактериального типа». В то же время продукты ферментации дождевого червя значительно увеличили активность почвенных ферментов и снизили концентрации фенольных кислот. Этот эффект может быть вызван влиянием исследуемых веществ на микробную среду грунта, в результате чего снизилась численность вредных грибов, увеличилось количество полезных бактерий, изменилась структура микробного сообщества, повысилась активность почвенных ферментов. В процессе перестройки некоторые микроорганизмы, обладающие способностью разлагать фенольные кислоты, также размножились. Индекс Шеннона в отношении грибов существенно уменьшился после обработки продуктами ферментации червя, а индекс Симпсона увеличился, что указывало на снижение разнообразия грибного сообщества при этой обработке по сравнению с другими видами операций.
ОПТИМИЗАЦИЯ ПОЧВЫ
Причины ARD сложны, при этом основные вредоносные грибы, связанные с болезнью, включают Cylindruria, Fusarium, Nutricaria, Phytophthora. Продукты ферментации дождевого червя оказывали наиболее сильное подавляющее действие на рост и прорастание спор Fusarium. Изображения, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа, показали, что активные компоненты, выделенные из жидкости полости дождевого червя, вызывали нарушение целостности клеточной стенки гриба, что приводило к гибели клеток в результате апоптоза и некроза. В проведенном эксперименте сканирующая электронная микроскопия использовалась для наблюдения за Fusarium, обработанным продуктами ферментации дождевого червя. Последние разрушили целостность мицелия гриба, что привело к повреждению его значительной части, ненормальному высыханию и гибели. Помимо этого в ходе проведенного анализа была доказана антибактериальная активность выделенных маломолекулярных активных пептидов.
Таким образом, результаты исследования показали, что оптимальными условиями ферментации дождевого червя являются pH, равный семи единицам, температура в 37°C и продолжительность воздействия в 10 дней. Производные продукты способны сокращать размножение Fusarium путем ингибирования роста мицелия, нарушения его целостности и подавления прорастания спор. В итоге использование подобных веществ может оптимизировать почвенную среду для пересадки яблонь, снизить численность Fusarium, стимулировать рост саженцев, улучшить качество плодов и облегчить возникновение ARD.
[1] Источник: Журнал Horticultural Plant Journal, опубликовано в сети Интернет 03.02.2024 г. Текст печатается с сокращениями по лицензии Creative Commons.