Шаги к победе над вирусом коричневой морщинистости плодов (ToBRFV)

Текст: Хакан Фидан, Дамла Улусой, Ханде Нур Албезирган, кафедра защиты растений сельскохозяйственного факультета, Университет Акдениз [1]

Вирус коричневой морщинистости плодов (ToBRFV) представляет собой значительную угрозу для производства томатов во всем мире. По этой причине ученые стремятся разработать интегрированную стратегию борьбы с этим заболеванием, охватывающую весь процесс выращивания культуры — от семян до сбора урожая.

Данная болезнь широко распространена в теплицах и на полях. Исследования показывают, что она переносится семенами и передается механическим путем, а также обладает высокой стабильностью. В связи с этим санитарная очистка семенного материала и предотвращение заражения являются неотъемлемыми аспектами борьбы с вирусом. Многие ученые стремятся расширить подходы к предотвращению появления болезни, в том числе путем испытания и сравнения различных составов, а также их сочетания с тепловой обработкой, ультрафиолетовым излучением и химическими средствами.

НАБОР ДЕЗИНФЕКЦИИ

Научные исследования с целью поиска новых путей борьбы с ToBRFV провели специалисты из турецкого университета. Генотип томата HK-1314 использовался для оценки эффективности различных подходов, а табак Бентама служил индикатором для мониторинга симптомов заболевания, помогая в определении продолжительности активности вируса. Томат HK-1314 выращивался в теплицах научного учреждения с расстоянием между рядами 40 см, растениями — 70 см.

В ходе опытов в санитарном анализе против ToBRFV использовалось несколько препаратов и веществ: Tsunami-100 от компании Ecolab — 30–60% уксусной кислоты, 15,2% пероксиуксусной кислоты и 11,2% перекиси водорода, Biocon A от KMK Laboratories — 50% пероксимоносульфата калия с буфером и органической кислотой, Desyclean от Sojall — перекись водорода, сорбиновая кислота, надуксусная кислота и бензоат натрия. Также применялись средства Bioxi от Biotem — озон O3, соляная кислота (18% HCl) от Sigma, Incidin от Ecolab — 10 г 2-феноксиэтанола, 8 г н-(3-аминопропила)-н-додецилпропана-1,3-диамина и 7,5 г бензалкония хлорида. Их концентрация была скорректирована в соответствии с требованиями производителей с изменением немного в меньшую и большую стороны. Для препарата Tsunami-100 значения равнялись 0,5, 0,75 и 1%, Biocon A — 0,5, 1 и 1,5%, Bioxi — 2, 2,5 и 3%, Incidin — 1, 1,5 и 2%, HCl — 0,1, 0,5 и 1% соответственно. Для ультрафиолетовой обработки семян использовали портативное устройство УФ-стерилизации производства Kechaoda.

РАСПОЛОЖЕНИЕ ОБРАЗЦОВ

В полиэтиленовую теплицу площадью 500 кв. м 30 октября 2021 года были высажены 306 саженцев томатов. Применялись стандартные методы культивирования, а комплексная программа питания и удобрения обеспечивала оптимальный уровень вегетативного и генеративного развития на протяжении всего периода роста культуры. Каждый ряд в теплице вмещал 51 растение. Дезинфектанты распылялись в указанных концентрациях в соответствии с рандомизированной схемой с полным блоком (RCBD). Одно растение в каждом ряду служило источником инокулята и было заражено ToBRFV. Таким образом, в эксперименте было 14 различных обработок — 12 дезинфицирующих средств, одна операция с водой, один положительный контроль с вирусом. В теплице было выделено шесть рядов, в каждом из которых оказалось по три растения для всех типов процедур. Для обеспечения опыления с целью однородного формирования плодов использовался земляной шмель, известный как носитель первичного инокулята ToBRFV. Это способствовало распространению болезни на томатах. Первоначальное внесение дезинфицирующего средства в сочетании с механическим загрязнением проводилось в теплице и повторялось с интервалом в 15 дней для второго и третьего применений, в результате чего всего было выполнено четыре операции.

ВИДЫ ОБРАБОТОК

Из каждой группы семян, полученных из зараженных вирусом томатов, три набора по 1000 единиц подвергались термической обработке различной продолжительности. В отношении первой партии температура повышалась с 20 до 72°C в течение 24 часов в модифицированной тепловой машине Delta. Вторая часть выдерживалась при 72°C еще 24 часа, а третья группа подвергалась обработке при 72°C на протяжении 48 часов в дополнение к предыдущей операции, которую проходил первый блок. В ходе исследования использовался контрольный набор, состоящий из 400 здоровых семян томатов. После обработки образцы из каждой группы были протестированы на наличие или отсутствие ToBRFV с помощью RT-PCR.

Помимо этого оценивалась эффективность воздействия ультрафиолетовым светом для уничтожения вируса в семенах. УФ-излучение с длиной волны 254 нм применялось к зараженному посевному материалу в течение 30 минут. Всего облучению подвергалась 1000 семян, которые были разделены на четыре группы. Каждая из них состояла из 250 единиц. Для определения наличия вируса был проведен тест DAS-ELISA в соответствии с установленными протоколами. Образцы готовили в соответствии с методом Международной ассоциации тестирования семян (ISTA), что позволило выполнять одновременное исследование нескольких экземпляров. В двух повторностях отбирали по 500 семян и тестировали их методом DAS-ELISA. Эта процедура повторялась три раза, и в результатах указывалось среднее значение.

В качестве исходного материала для каждой обработки дезинфицирующим средством использовали около 1000 семян, на которые после разбавления водой наносили по отдельности шесть различных растворов в заданных пропорциях. Далее каждый набор из 1000 семян был разделен на четыре группы — по три разные концентрации и контроль. Каждая из них содержала 250 семян. Помимо этого в рамках опыта исследовались различные комбинации операций в группах по 300 образцов. В первой партии термообработка была первоначально применена к 300 зараженным семенам, после чего использовалось это же воздействие с добавлением дезинфицирующего средства. В другой группе применялась комбинация тепловой обработки и ультрафиолетового облучения. Кроме того, все три метода, то есть термообработка, дезинфектант и УФ-лучи, использовались одновременно. Такой подход позволил оценить эффективность методов в уничтожении ToBRFV.

ЗАРАЖЕННОЕ ОКРУЖЕНИЕ

Время активного выживания вируса коричневой морщинистости плодов зависит от инструментов и оборудования, используемых в тепличном производстве, включая перчатки, секаторы, ящики для сбора урожая, веревки для подпорки, горшки для растений и одежду, надеваемую во время опрыскивания и сельскохозяйственного труда. Эти материалы, являющиеся неотъемлемой частью ежедневной деятельности, играют ключевую роль в прямой передаче заболевания от одного растения к другому. В связи с этим во время опытов для оценки также были отобраны различные материалы, включая инструменты и оборудование, металлические детали, хлопчатобумажную ткань, стекло, нитки и пластик. Их погружали и извлекали из фосфатно-буферного раствора, содержащего ToBRFV. Затем с каждого экземпляра были взяты образцы мазков с интервалом в 1, 8, 24, 48 и 72 часа. Затем их наносили на отдельные пронумерованные растения томатов и табака для инокуляции.

Взятие мазков с двух культур через определенные промежутки времени на шести различных поверхностях — на хлопчатобумажной ткани, металлических деталях, латексных перчатках, стекле, веревках для обвязки и пластика — инициировало образование симптомов, которые отмечались через две недели после инокуляции. Наблюдение показало, что 26 из 72 растений не продемонстрировали никаких проявлений. Тесты RT-PCR на таких образцах подтвердили, что они были свободны от болезни.

ИНАКТИВАЦИЯ ВИРУСА

При тщательном изучении уровень заражения ToBRFV в эндосперме в первом опыте равнялся 0,7%, во втором — 0,8%, в третьем — 0,9%, в четвертом — 0,8%. В среднем вирус обнаруживался в 8 из 1000 семян, что составило 0,8% эндосперма. После трехдневного применения сухого воздуха только 3 из 1000 образцов были признаны положительными по ToBRFV. Для оценки патогенности вируса 1000 семян были высеяны и проконтролированы в теплицах. Молекулярные тесты проводились на 7, 14, 21, 28 и 45 дни. Результаты эксперимента показали, что после термической обработки вирус утратил способность к заражению, став неинфекционным. Несмотря на то, что уровень распространения составил 0,3%, воздействие температурой привело к инактивации патогена. Помимо этого оценивалось влияние этой операции на скорость прорастания с помощью 400 случайно отобранных семян. Коэффициент составил 95,8%, при этом 384 единицы успешно проросли и только 16 экземпляров этого не продемонстрировали.

ЗАВИСИМОСТЬ ОТ ДОЗЫ

При оценке растений из семян, обработанных дезсредствами, фиксировалось заметное снижение симптомов ToBRFV на листьях. В то время как большинство препаратов демонстрировало эффективность при различных нормах, продукт Desyclean даже при самой высокой дозе в 3% оказался менее успешным в предотвращении заражения и уменьшении проявлений по сравнению с другими дезинфектантами. Увеличение концентрации Tsunami-100, Bioxi, Biocon А, Incidin и HCl привело к сокращению симптомов и полному предотвращению возникновения ToBRFV, что подтверждалось оценкой инокулированных растений. В группе обработки Desyclean хотя и наблюдалось дозозависимое снижение проявлений вируса, не было обнаружено бессимптомных образцов. Однако использование второй нормы препарата оказалось наиболее эффективным, что еще раз подчеркнуло влияние дозы на результативность дезинфицирующих средств в предотвращении и смягчении инфекции ToBRFV. Примечательно, что самая высокая концентрация HCl в 1% привела к деформации посевного материала при всхожести в 80%. Предполагается, что повышенная кислотность вещества оказала потенциально вредное воздействие на оболочку семян. При применении средств Tsunami-100 и Biocon А в концентрации по 1% всхожесть фиксировалась на уровне 96–98%.

Часть бессимптомных растений, случайным образом отобранных из 28 образцов, была подвергнута тестированию RT-PCR на наличие вируса. Из исследованных растений 12 экземпляров продемонстрировали положительный результат, несмотря на отсутствие типичных симптомов. Затем для каждой обработки был проведен тест DAS-ELISA для оценки нагрузки ToBRFV на листья. Растения со значениями абсорбции от 0,3956 до 1,7109 демонстрировали легкие и умеренные проявления мозаики, в то время как при показателях от 1,3697 до 2,7989 наблюдались тяжелые симптомы и деформации листовых пластин. Снижение вирусной нагрузки напрямую коррелировало с обработкой семян дезинфицирующими средствами, что соответствовало шкале оценки проявлений. Препараты Tsunami-100 в концентрации 0,75 и 1%, Bioxi в 2,5 и 3%, Biocon А в 1,5%, HCl в 1% и Incidin в 2% продемонстрировали высокую эффективность в снижении вирусной нагрузки на листья.

КОМПЛЕКС ДЛЯ УНИЧТОЖЕНИЯ

Среди всех методов наиболее успешным в уничтожении ToBRFV в семенах оказалось сочетание тепловой обработки и дезинфицирующего средства. Так, посевной материал, замоченный в 10%-ном растворе тринатрийфосфата (ТФФ) на три часа с последующей тепловой обработкой при 72°C в течение 72 ч, показал самую низкую вирусную нагрузку по сравнению с образцами, подвергшимся другим операциям.

Наблюдения в теплицах и полях основывались на наличии или отсутствии симптомов, при этом не принимались во внимание некоторые факторы, в частности плотность растений и условия окружающей среды. Результаты теста DAS-ELISA показали, что после последней обработки дезинфицирующим средством 15 тепличных образцов были признаны негативными, поскольку их абсорбция была ниже в три раза, чем у отрицательного контроля. Среди этих образцов вирус был обнаружен в 87 случаях. Наибольшее значение абсорбции при длине волны 405 нм составило 3,2022 у растений положительного контроля, непосредственно зараженных вирусом. В экземплярах, обработанных дезинфицирующими средствами, максимально данный параметр равнялся 2,1893 у растений после первой дозы HCl, а минимальное значение в 0,2991 отмечалось у образцов после наибольшей концентрации препарата Biocon A.

Тесты RT-PCR на 15 образцах, отрицательных при исследовании DAS-ELISA, не выявили статистических различий между репликами в эксперименте. Разницу между дезинфектантами оценивали с помощью анализа LSD. Положительный контроль имел наибольшее значение. При изучении показаний абсорбции DAS-ELISA у растений, обработанных дезинфицирующими средствами HCl, Bioxi и Desyclean, наблюдался сходный уровень эффективности, в то время как образцы после воздействия средств Tsunami-100 и Biocon A оказались в группе с наименьшими значениями загрязнения. Статистическая разница между нижней и верхней дозами не фиксировалась, однако самые высокие нормы дезинфицирующих средств эффективно снижали значение абсорбции в тесте DAS-ELISA. Было замечено, что более высокие концентрации препаратов HCl и Tsunami-100 оказывали негативное воздействие на листья растений.

ИТОГОВЫЕ ВЫВОДЫ

Результаты обработки семян для уничтожения ToBRFV сравнивались при использовании ультрафиолета, дезсредств, тепла и их комбинаций. Эксперимент показал, что после теплового воздействия вирус терял способность к заражению, однако УФ-облучение не оказывало заметного влияния на его патогенность. Таким образом, термическая обработка, включающая постепенное нагревание с 20 до 72°С в течение трех дней, может считаться эффективным методом снижения повреждений у томата, вызванных ToBRFV, в отличие от ультрафиолета.

При обработке семян дезинфицирующими средствами отмечались положительные результаты у ряда продуктов, однако фиксировались и побочные эффекты. В связи с этим концентрацию и дозу протравителя необходимо тщательно подбирать, поддерживая минимальный уровень для снижения активности патогена при максимальном увеличении скорости прорастания. Данные параметры могут различаться для разных растений, что требует тщательного изучения их эффективности. Сочетание обработки дезинфицирующими средствами с тепловым воздействием обеспечивает более безопасный подход к уничтожению ToBRFV.

Прямое применение протравителей в контролируемых условиях объяснялось химическим нарушением структуры белка оболочки вируса и их влиянием на вирулентность в треугольнике болезни, изолированном от факторов окружающей среды. Следует учитывать, что в теплице дезинфицирующие препараты оказались эффективными в рекомендованных концентрациях, однако в полевых условиях их действенность снизилась. Прямое применение не может полностью уничтожить вирус ToBRFV в поле, хотя и задерживает появление симптомов и время распространения. Более того, после обработки патоген представлял опасность в течение 48 ч в тепличных условиях, о чем свидетельствовали мазки, взятые со стеклянных поверхностей. Это подчеркивает, что инфекционная способность вирусов растений варьирует на различных поверхностях, а температура окружающей среды является важным фактором для ее сохранения. Потенциальными источниками распространения ToBRFV в теплицах и на полях выступают часто используемые приспособления, в частности горшки, контейнеры для растений и почвы, садовые совки, лопаты и лотки для питомников, что подчеркивает необходимость замены, стерилизации или утилизации оборудования для предотвращения передачи. Следование мерам предосторожности и проведение эффективных обработок — стратегия для минимизации потерь урожая от вируса ToBRFV при выращивании томатов.

1 Источник: Журнал Agriculture, 2024, 14 (1). Текст печатается в переводе и с сокращениями по лицензии Creative Commons