Активность ферментов — фактор успешного возделывания картофеля
Текст: М. К. Гулов, канд. биол. наук, доц., Таджикский государственный медицинский университет имени Абуали ибни Сино; Н. Х. Норкулов, канд. биол. наук, вед. науч. сотр., К. Партоев, д-р с.-х. наук, зав. лабораторией генетики и селекции, Институт ботаники, физиологии и генетики растений Национальной академии наук (НАН) Таджикистана
Природные стрессовые факторы, в частности засуха, высокая температура, засоление почвы и другие, провоцируют в клетках растений чрезмерную выработку активных форм кислорода. По этой причине для регулирования процесса роста, развития и физиологической активности, заложенной в генотипе культуры, можно использовать особенности ее толерантности к воздействию внешней среды.
Антиокислительная система является одним из механизмов защиты растений от неблагоприятных факторов, однако разные организмы неодинаково реагируют на изменения окружающих условий. Например, при высокой температуре корни могут быстро использовать весь имеющийся кислород, что приведет к его недостатку или даже полному отсутствию — аноксии. В свою очередь, данный процесс влияет на физиологию или иногда обусловливает гибель посадок.
ВАЖНЫЕ КОМПОНЕНТЫ
Для многих стран особое значение имеет температурный фактор, в первую очередь влияющий на гомеостаз в клетках растений многих культур, в том числе картофеля. Как известно, оптимальный водный режим создает благоприятные условия для биохимических реакций, обеспечивающих высокую продуктивность растений. Недостаточное и избыточное увлажнение почвы отрицательно сказывается на протекании ряда физиолого-биохимических процессов. Например, при сильном дефиците воды в почве задерживается биосинтез органических соединений и усиливается гидролиз, в результате чего нарушаются ростовые стадии. В ответ на водный дефицит синтезируются белки, способствующие удержанию внутриклеточной жидкости, участвующие в трансмембранном переносе молекул воды, и активируются антиоксидантные системы, препятствующие развитию окислительного стресса. В связи с этим особую актуальность приобретает изучение физиологической адаптивности растений к природным стрессовым факторам.
Одним из показателей биологической устойчивости растений к постоянно меняющимся условиям внешней среды является изменение активности антиоксидантных ферментов. Так, под воздействием водного стресса происходит усиленное образование активных форм кислорода (АФК) в организме, в частности супероксид-радикала (О2–), гидроксил-радикала (ОН–) и перекиси водорода Н2О2, стимулирующих ферменты. Роль последнего вещества при стрессе двойственна. Во многих случаях оно участвует в передачах сигналов как вторичный мессенджер, предохраняющий растение от стресса, включая синтез антиоксидантов. Для защиты от воздействия свободных радикалов в клетках имеются другие компоненты антиокислительной системы, поддерживающие уровень АФК в тканях. Наиболее важными из активных форм кислорода являются супероксиддисмутазы (СОД), которые дисмутируют с образованием перекиси. При этом каталаза (КАТ) и пероксидаза (ПО) расщепляют Н2О2 на воду и молекулярный кислород, в то время как ПО разрушает Н2О2 путем окисления ряда субстратов — фенолов и/или антиоксидантов.
ОПЫТЫ С ВЕЩЕСТВАМИ
С целью изучения динамики активности антиоксидантной системы защиты растений картофеля и участвующих в детоксикации форм кислорода в условиях высокой температуры и водного дефицита специалистами были проведены научные исследования. В качестве их объектов использовался коллекционный материал картофеля Института ботаники, физиологии и генетики растений Академии наук Республики Таджикистан. Работа осуществлялась в условиях Хуросонского района, расположенного на высоте 550 м над уровнем моря, где среднесуточная температура воздуха во время вегетации составляла 27–29ºС. Сортообразцы выращивались на основе общепринятой агротехники. Применялись три сорта — Файзабад, Таджикистан и Нилуфар. В фазе цветения анализировалась активность антиоксидантных ферментов — супероксиддисмутазы, каталазы и аскорбатпероксидазы (АПО). В первом случае показатели определялись по способности СОД ингибировать фотохимическое восстановление нитросинего тетразолия. За единицу активности принималось количество фермента, способного подавить реакцию восстановления тетразолия на 50%. Для этого полученная оптическая плотность максимального образования формазана делилась на два и принималась за 50% ингибирования, или 0,5 единицы. Расчет производился по формуле: а = 1 – ((Dобр.×0,5) / (Dформазана/2)). Активность СОД высчитывалась согласно выражению А = (а×V×X) / (m×L). В этом случае A являлась действенностью фермента, а — относительной единицей активности в соответствии с предыдущей формулой, V — объемом полученной вытяжки в миллилитрах, X — конечным разведением вытяжки в кювете, L — толщиной слоя в миллиметрах, m — массой сырой навески в миллиграммах. Активность СОД устанавливалась в граммах сырой массы.
ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
Активность каталазы определялась по скорости разложения Н2О2. Для этого порция листьев массой 200 мг гомогенизировалась в калийсульфатном буфере объемом 2 мл при рН, равном 6,8 единицы. Полученное вещество центрифугировалось при 12 тыс. об/мин в течение 10 минут. Супернатант использовался как ферментный препарат. К его количеству в 0,1 мл добавлялись 0,9 мл калийфосфатного буфера, после чего реакция запускалась добавлением 100 мкл перекиси водорода, затем немедленно фиксировались изменения экстинкции при 240 нм через каждые пять секунд на спектрофотометре Ultrospec-II. В качестве контроля применялся калийфосфатный буфер. Активность пробы рассчитывалась по формуле: A = (Е240 нм×n) / (39,4×m) и выражалась в мМ перекиси водорода на грамм сырой массы в минуту.
Активность аскорбатпероксидазы устанавливалась по скорости убывания аскорбата. К 200 мг листьев добавлялись 2 мл 50 мМ калийфосфатного буфера при рН, равном 7,8 единицы. Затем 10 минут проводились гомогенизация и центрифугирование при 15 тыс. об/мин. Супернатант использовался как ферментный препарат. Реакционная смесь содержала 100 мкл ферментного экстракта, 50 мкл аскорбиновой кислоты, 50 мкл ЭДТА и 0,8 мл калийфосфатного буфера, а общий объем составлял 1 мл. Реакция начиналась с добавлением 100 мкл Н2О2, измерения осуществлялись при 290 нм на том же спектрофотометре. Контролем служили пробы без препарата. Активность фермента рассчитывалась по формуле: А = (Е290×V) / (m×2,8) в мМ. В этом случае А обозначало содержание аскорбата на грамм сырой массы растения в минутах, E290 — оптическую плотность раствора, V — объем реакционный среды в миллилитрах, m — массу сырой навески, а 2,8 — коэффициент аскорбата. Кроме того, определялся водный дефицит сортов в листьях. Статистическая обработка данных проводилась с использованием компьютерной программы Microsoft Excel 2007 и по Б. А. Доспехову.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ
Ключевым антиоксидантным ферментом, который участвует в процессе детоксикации активных форм кислорода, является супероксиддисмутаза. Результаты исследования показали, что температура воздуха по-разному влияет на ее активность. Так, высокие значения данного показателя для СОД наблюдались у устойчивого сорта Таджикистан — 238 мкм/г сырой массы, в то время как у картофеля Файзабад отмечалась средняя величина — 137,2 мкм/г. Сравнительно низкий параметр в этих условиях фиксировался у клона Нилуфар — 34,6 мкм/г. Схожая зависимость от высокой температуры была зарегистрирована у другого фермента — каталазы.
Антиоксидантные ферменты взаимосвязаны, поэтому активность КАТ и АПО, участвующих в превращении перекиси водорода в воду и молекулярный кислород, коррелировала с показателями СОД, занятой в формировании Н2О2. При этом предполагалось, что повышение действенности компонентов защиты было обусловлено избыточным накоплением АФК в клетках растений, находящихся в условиях стресса. Следует отметить, что активность антиоксидантных ферментов зависела от степени подверженности культуры негативному воздействию. Так, в клетках более устойчивых сортов картофеля при стрессовом влиянии данные параметры у супероксиддисмутазы и каталазы оказались выше, чем у не толерантных сортов. Сравнительный анализ показал, что большая активность каталазы наблюдалась у резистентного сорта Таджикистан: при высокой температуре воздуха она достигала 6,42 ммоль/г сырой массы. У картофеля Файзабад и клона Нилуфар данная величина была гораздо ниже — 4,34 и 3,32 ммоль/г соответственно.
ЗАЩИТА КЛЕТОК
Иная закономерность у изученных образцов наблюдалась для активности аскорбатпероксидазы при воздействии высоких температур, что было обусловлено генотипическими особенностями. Анализ результатов исследования показал, что АПО вносила вклад в репарацию растений в ходе окислительного стресса, спровоцированного жарой. При этом по мере возрастания температуры воздуха у устойчивого сорта Таджикистан отмечалось снижение активности данного фермента. В листьях картофеля Файзабад действенность АПО по сравнению со значениями для других сортов была максимальной — 4,876 ммоль/г сырой массы. При воздействии стресса у клона Нилуфар и сорта Таджикистан наблюдалась низкая активность аскорбатпероксидазы — 1,035–2,81 ммоль/г. Возможно, в этот период высокая температура воздуха усиливала синтез de novo других антиоксидантных ферментов, например изоформы каталазы, что вызывало уменьшение концентрации перекисей и, следовательно, защиту клетки от окислительного стресса.
Влияние повышенных температурных значений, часто сопровождаемых засухой, обусловливало длительный дефицит воды из-за недостаточного ее поступления из почвы. Данный фактор по-разному воздействовал на генотипы картофеля. Высокие показатели недостатка жидкости наблюдались у клона Нилуфар — 25,06%, в то время как у сортов Файзабад и Таджикистан, наоборот, они были сравнительно ниже — 20,41 и 17,65% соответственно, что свидетельствовало об их устойчивости к жаре.
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ В ПРОЦЕССЕ
Таким образом, на основе полученных в ходе исследований результатов был сделан вывод, что высокая температура воздуха увеличивает активность всех трех антиоксидантных ферментов у изученных генотипов картофеля — СОД, КАТ и АПО. Различия наблюдаются в зависимости от степени восприимчивости к стрессу. У устойчивого сорта Таджикистан зарегистрированы значительные показатели активности супероксиддисмутазы и каталазы на фоне низких цифр для аскорбатпероксидазы. Уменьшение значений у этого фермента в данном случае может быть связано с тем, что он высокоспецифичен к аскорбату и быстро теряет активность. Необходимо отметить, что в стрессовых условиях устойчивость изучаемых сортов была связана с существенной активностью каталазы, участвовавшей в детоксикации активных форм кислорода в клетках растений. На базе полученных научных результатов можно предполагать, что СОД и КАТ у анализируемых генотипов дополняли друг друга в процессе адаптации к негативному внешнему воздействию.
Высокая температура воздуха сама по себе выступает как стрессовый фактор и одновременно приводит к водному дефициту, тем самым отрицательно влияя на активность антиоксидантных ферментов картофеля. Сравнительный анализ полученных данных показал, что при увеличенной действенности таких ферментов у растений этой культуры наблюдался невысокий недостаток жидкости. Наоборот, при низких параметрах отмечалось возрастание уровня нехватки воды. Таким образом, активность СОД, КАТ и АПО способствовала усилению адаптивной реакции в условиях стрессового воздействия и устойчивости генотипов картофеля к проявлениям жаркого климата.